干貨 | 鎂孚泰酶改造技術經(jīng)驗分享：高質量突變體文庫構建全流程避坑指南！

1.調整易錯PCR的金屬離子濃度和dNTP比例，并進行測序抽檢，確保突變均勻分布；

2.突變率一般控制在1-5個/kb，避免頻率低文庫多樣性不足，或過度突變產(chǎn)生非功能性文庫；

3.隨機突變提文庫的克隆數(shù)不宜超過文庫理論多樣性的十分之一；

4.PCR、電轉化等過程可能出現(xiàn)大量不完整的DNA片段，影響文庫質量，可通過EXOⅢ外切酶處理去除短片段；

5.結合不同誘變方法（如首輪易錯PCR，次輪DNA shuffling）以打破局部最優(yōu)；

6.利用簡并引物可快速構建包含多個突變體的不同突變位點的Shuffling文庫。

1.可通過密碼子優(yōu)化或使用融合標簽（如His-tag、MBP、SUMO等）提升可溶性表達；

2.使用在線工具優(yōu)化密碼子，確保目標蛋白的密碼子與宿主菌株的密碼子偏好性一致；

3.定點突變時，需要考慮密碼子偏好性，并盡可能避免引入有害突變。

保留隨機文庫質粒，防止菌體文庫退化，若已退化可用質粒重新轉化。